納米孔傳感器可以檢測通過納米孔的離子電流變化，實現單分子靈敏度，已成功用于檢測生物標志物，包括核酸、蛋白質和小分子。但在對超低濃度（亞皮摩爾）分子進行定量分析時，面臨響應時間長的問題，因為分析物擴散到納米孔的時間常數與分子必須擴散的距離成平方。同時，在復雜的樣品中，如生物體液，樣品中通過納米孔傳感器易位的其他物質也會在離子電流中表現出電阻脈沖，這意味著臨床樣品的選擇性可能是一個挑戰。

為了克服這些挑戰，來自于澳大利亞新南威爾士大學的研究人員提出了一種光學納米孔阻斷傳感器方法，能夠快速檢測超低濃度的物質。

研究人員使用的模型分析藥物是血管內皮生長因子（VEGF），將熒光聚苯乙烯納米顆粒（PSNPs）用抗VEGF抗體修飾，形成Ab-PSNPs，而納米孔陣列的表面用抗VEGF適配體修飾，形成適配體納米孔，通過在納米孔上施加電場，將Ab-PSNP帶到適配體納米孔中。通過計算納米孔陣列（676個納米孔）中阻斷與解阻事件的比率，量化亞皮摩爾濃度下的VEGF量。

研究人員沒有通過離子電流的變化來確定阻斷事件，而是利用熒光納米顆粒和寬視場顯微鏡作為讀出機制，從而實現可同時監測數百個納米孔，顯著增加了可檢測到的阻斷事件的數量，使納米孔阻斷傳感器實現定量。

首先，研究人員在沒有任何表面修飾的情況下，用裸露的納米孔測量裸露的PSNP的封閉事件。當不施加電壓時，沒有熒光信號；當向反式室施加1.5 V的電壓時，觀察到許多熒光信號，證明通過電場可以將納米顆粒驅動進入納米孔。

為了增強納米孔表面的抗污染性能，以減少非特異性結合，研究人員研究了納米孔表面化學功能化，以及非特異性顆粒從不同直徑納米孔中移除的去除效率。實驗成功地展示了通過電場控制可以區分特異性和非特異性結合的事件，且通過選擇合適的納米孔直徑和電場條件，可以有效地移除非特異性結合的納米顆粒，提高了傳感器的選擇性和準確性。

接下來，研究人員展示了根據可以從孔隙中去除的顆粒數量（非特異性事件）和施加負電壓時留在孔中的顆粒數量（特定事件）來檢測目標蛋白質VEGF的能力。實驗結果表明，利用光學納米孔阻斷傳感器可以成功區分特異性和非特異性事件，通過計算施加負電壓后留在孔中的顆粒百分比，可以定量分析VEGF的濃度。

最后，研究人員使用不同濃度的VEGF與固定濃度的Ab-PSNP進行定量檢測實驗，所用VEGF濃度從0到7.895 pM，在不同濃度下，Ab-PSNP與VEGF的結合比率如下圖所示。同時，實驗能夠檢測的VEGF濃度為78.75 fM（3 pg/mL）。

總之，研究人員展示了一種在高密度納米孔陣列（676個納米孔）中獨立監測熒光納米顆粒阻斷/解阻事件的技術，可用于使用單分子計數來定量分析超低濃度的分析物，并證明了其在亞皮摩爾范圍內定量蛋白質VEGF的能力。

未來，該技術可能擴展到其他在生物樣本中以超低濃度存在的分析物的檢測，通過增加檢測的納米孔數量，可以提高檢測的靈敏度。

來源：傳感器專家網